1、低pH孵育病毒灭活简介
在生物制品生产工艺中，病毒去除和灭活是至关重要的一个工艺步骤，CDE《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》及ICH Q5A《来源于人或者动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评估》中明确规定来源于动物细胞系的生物技术产品至少需要两种不同原理的病毒灭活/去除的步骤来保证产品无病毒污染。在抗体工艺流程设计中，典型的设计是在Protein A亲和层析后加上低pH孵育病毒灭活的工艺，低pH是最常用的病毒灭活方法，此方法相对简单、占地面积小并且通常不需要干预或者附加步骤即可灭活病毒。一个典型的病毒灭活操作包括酸化（VIA）和中和（VIN）步骤，亲和层析产物被调整到 pH 值3.6左右，并保持一段时间，以实现足够的病毒灭活，调节到接近中性的 pH 值（VIN），以便下一步处理。
2、研究意义
在IgG4单克隆抗体（mAb IgG4-N1）的低pH病毒灭活（VI）放大过程中，观察到大量可溶性产物聚集，而在相同条件下的小规模实验显示聚集可忽略不计。混合不均匀和产品暴露于低pH被确定为根本原因。为了解释该问题的机理，通过改变关键参数（包括pH、放置时间和蛋白质浓度）来研究蛋白质聚集特性。
此研究通过将IgG4-N1的分子性质和各种过程相关参数与宏观聚集现象联系起来，揭示了其在酸性条件下的主要聚集机制。这项研究还为下游VI操作中低pH诱导IgG4聚集的原因和缓解策略提供了有用的建议。
使用含有66.5 L PAE（亲和层析洗脱收集液）且叶轮搅拌速度为50 rpm的SUM-100 Mixer进行IgG4-N1放大生产的VI。如表1所示，VIA和VIN样品的HMW聚集水平分别为1.7%和7.1%。VIN样品中的聚体量超过了IPT标准，并导致该批次生产失败。
随后进行了实验室规模试验，以模拟放大条件。在50 mL小烧杯中使用与放大操作相同的酸碱添加比例并使用磁力搅拌棒进行充分混合。如表1所示，实验室规模的VIA和VIN样品的HMW水平分别为1.3%和2.4%，远低于放大生产的HMW含量，因此VIN过程中显著的聚体形成与规模有关。由于放大规模中 SUM-100 Mixer使用顶部安装的叶轮，两个规模混合条件的差异可能会导致产品聚集差异。为了测试这一点，酸滴定过程进行搅拌与不搅拌对比实验，发现两组实验VIA和VIN样品的HMW水平分别从1.3%增加到3.5%和2.4%增加到13.0%。为了从机理上理解导致产物聚集的关键因素，我们进一步研究了IgG4-N1在相关溶液条件下的分子特性。
pH的影响：
在pH 3.0-3.8之间研究了VIA的pH值对IgG4-N1聚集的影响，对pH值为5.5的VIN样品进行测试，以评估IgG4-N1暴露于各种VIA pH条件后的聚集行为。pH5.5 VIN样品的聚体水平通常在VIN pH值调节后约20小时达到稳定（如下所述），因此，在进行SEC测定前，将样品储存一夜。在较低的VIA pH值（图1a）下，VIN样品的HMW水平从1.6%（pH3.8）非线性增加到约70%（pH值为3.0），表明较低的pH值会显著导致IgG4-N1聚集。
Hold time的影响：
在评估HMW水平之前，将IgG4-N1 PAE样品调节至pH 3.3，在室温下放置不同时间（从20分钟到24小时）。如图1c所示，当直接测定VIA样品SEC而不进行pH回调时，SEC色谱图上观察到明显的前肩峰，并且肩峰的大小随VIA放置时间延长成比例增加。SEC-MALS数据（图1e，f）表明，对应于前肩峰组分与天然单体具有相同的分子量，因此可能是具有较大流体动力学半径的部分未折叠组分。为了研究VIN放置时间的影响，在SEC检测前，将放置3小时的VIA样品中和至pH 5.5，并在室温下放置不同时间（从10分钟到24小时）。在图1d中，在pH 3.3下观察到的前肩峰随着VIN放置时间增加而减少，并在24小时后最终消失，同时伴随着高分子量聚集物的增加。
pH、Hold time以及蛋白浓度的交互影响：
使用JMP®软件设计的全析因实验设计评估了通过pH、放置时间和IgG4-N1聚集的蛋白质浓度之间的相互作用。为了有助于此评估，通过使用单体衰减指数方程（方程1：）拟合动力学实验的单体分数来获得聚集速率常数（k值）。如图2a所示，由于蛋白质浓度对IgG4-N1聚集的影响在较低pH下更为明显，因此较低的蛋白质浓度产生较低的聚集电位。图2b和2c中的曲线分别显示了pH为5.5 VIN的样品的相对聚集和单体含量，这些样品最初在30.0 g/L的蛋白质浓度下经受过较低的pH（3.0-3.6）。图2d中的等高线图总结了符合方程1的数据。结果表明，随着pH的降低，k以非线性方式增加（在pH约为3.3时观察到拐点），并随着蛋白质浓度进一步增加。根据拟合曲线计算出的单体和高分子量值与此条件下的实验数据非常一致，因此，模型拟合的k值可用于比较不同VI条件，并提供了聚集倾向的定量评估，而无需对每个单独条件进行实验。例如，在图2e和2f中，“5分钟时HMW%”和“稳定期HMW%”的等高线图表明，由于产品聚集动力学强烈依赖于pH，VIA放置时间对VIN样品中的HMW水平有显著影响。
表2 IgG4-N1在不同pH条件下的Tm值
图3 IgG4-N1在不同放置时间下的VIA和VIN样品的荧光强度。（a）在pH 3.3下放置不同时间（10分钟-3小时）的VIA样品（b）VIA在pH 3.3放置1小时，VIN样品在pH 5.5下放置不同时间（0分钟 - 48小时）。
图4 不同放置时间的VIA和VIN样品的在线荧光SEC数据。（a）在pH 3.3下不同放置时间（10分钟-3小时）的VIA样品在线荧光扫描结果。垂直虚线对应8.25分钟的放置时间。（b）a中相同样品的UV 280 nm信号叠加。(c) VIN样品在pH 5.5下不同放置时间（10分钟24小时）的荧光扫描（ VIA样品在pH 3.3放置1小时）。（d）c中相同样品的UV 280 nm信号叠加。
图5 不同pH条件下VIA样品的KD值
3.4表面电荷
如图5a所示，随着pH的降低，净电荷如预期般增加，而总电荷减少。如前所述，较低pH下的净电荷和总电荷有助于排斥静电相互作用，阻碍单体缔合和相对良好的胶体稳定性。然而，分子内排斥不可避免地影响维持蛋白质天然结构的静电、范德华力和氢键力的平衡，这解释了在较低pH下构象稳定性较低的原因。
图6 IgG4-N1在不同pH条件下的电荷特性（a）pH 3.0-7.0时的净电荷和总电荷，以及相应的表面电荷分布，其中正电荷、负电荷和中性电荷分别用蓝色、红色和白色表示。（b）pH 4.5、3.6和3.3时的表面电荷分布，其中pH 4.5（CH2）时带负电荷的团簇以黄色和红色圈出。
3.5缓冲组分以及赋形剂对聚集的影响
图7 缓冲液组分和赋形剂对酸诱导IgG4-N1聚集速率常数k值的影响。
3.6 CFD建模来解决低pH VI操作的放大挑战
表3 SUM-100和SUM-50两种Mixer中的VI操作参数及表现
图8 采用CFD模拟SUM运行混合条件。(a) SUM-100型在非优化混合条件下运行1。（b）SUM-100型在优化混合条件下运行2。（c）SUM-50在优化混合条件下运行3。(d) 三次运行的积分低pH区（m3 s）作为时间的函数，以秒（s）为单位。（a）、（b）和（c）中的局部低pH区域（≤pH 3.3）用红色表示。
4、结论
4.1 IgG4-N1的低pH VI过程中形成聚体的影响因素
混合条件较差会导致VIA过程中形成低pH区，并在VIN过程导致严重的产物聚集。IgG4-N1的聚集倾向在pH 3.0–3.3时比在pH 3.6–8.5时要快得多。
在pH 3.3–3.6之间，观察到聚集速率常数对蛋白质浓度（7.5–30 g/L）的弱依赖性，在pH值3.0–3.3之间观察到更强的依赖性。
4.2 IgG4-N1的低pH VI过程中分子行为的描述
在VIA步骤中，低pH条件促进强烈的分子内排斥，导致以表面疏水性增加为特征的部分单体去折叠。这些未折叠的组分比天然单体略大，在SEC色谱图中出现在单体峰的前肩。另一方面，这些单体的强电荷排斥促进了胶体稳定性并防止聚集体形成。
在VIN滴定和放置期间，蛋白质上的排斥电荷在相对中性的pH环境下减少，降低胶体稳定性，并通过分子间相互作用导致了产物聚集。同时，分子内相互作用使得未折叠的单体逐渐变为表面疏水性降低的天然折叠结构。构象改变的单体的复性是与聚集的发生是相互竞争的，这取决于溶液条件和这两个途径之间的相对能量有利性。
4.3 实际应用
IgG4-N1聚集主要归因于酸滴定过程中的非均相混合条件，使用小规模的混合设备时该影响通常是微不足道的，但当使用大规模的系统时需要额外的注意。另外改善缓冲组分或添加赋形剂可适当减小聚集倾向。
文献来源：[1]. Weixin Jin, Zizhuo Xing, Yuanli Song, Chao Huang, Xuankuo Xu, Sanchayita Ghose & Zheng Jian Li (2019) Protein aggregation and mitigation strategy in low pH viral inactivation for monoclonal antibody purification, mAbs, 11:8, 1479-1491, DOI: 10.1080/19420862.2019.1658493
